概述

凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和 DNA 序列相互结合的技术，最初用于研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用，已经成为转录因子研究的经典方法。基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测 DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

生物体内 DNA 转录成 RNA 是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。

在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-acting elements）和反式作用因子（trans-acting factors）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因 5』端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和 DNA 序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。

我们知道，结构基因组学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定；难以比较不同片断之间亲和力大小的差异；对于蛋白复合体与 DNA 的结合也无法鉴定。由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）很难真正重建体内蛋白质与 DNA 之间结合过程。对 EMSA 进行改良或发展更好的研究蛋白质与 DNA 互作的技术很有必要。
 

 
实验操作

1. 细胞核蛋白提取

① 1×10⁷ 细胞用 PBS 洗两次，每次 4 ℃，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清；

② 加入预冷的 1 mL Buffer 1，10 μL PMSF，10 μL protease inhibitor cocktail 和 10 μL DTT，重悬细胞后，剧烈涡旋 10 秒钟充分混匀，冰浴 10 分钟；

③ 4 ℃，1400 g~2500 g 离心 5 分钟，弃上清；

④ 加入 200 μL 预冷 Buffer 2，2 μL PMSF，2 μL protease inhibitor cocktail，2 μL DTT，涡旋充分重悬沉淀，冰浴 20 分钟，每隔 2 分钟高速剧烈涡旋 15~30 秒钟充分混匀；

⑤ 4 ℃，12,000 g~16,000 g 离心 10 分钟，弃沉淀，上清为核提取物；

⑥ 考马斯亮蓝或 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度；

⑦ 蛋白样品 -80 ℃ 保存备用。

2. EMSA 胶的配制：

① 按照如下配方配制 6 ml 5％ 的聚丙.烯酰胺凝胶：
 

试剂	体积
TBE buffer (10X)	0.3 mL
重蒸水	4.15 mL
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)	0.75 mL
20% 甘油	748 µL
10% 过硫.酸铵 (ammonium persulfate)	45 µL
TEMED	3 µL

② 按照上述次序加入各个溶液，加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅.烷化处理。

3. EMSA 结合反应：
① 结合反应体系
② 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25 ℃）放置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温 (20-25 ℃) 放置 20 分钟。

4. 电泳分析

（1）电泳
① 加入 1.7µL 上样缓冲液，混匀后立即上样；
② 用 0.5×TBE 作为电泳液。按照 10V/厘米的电压预电泳 10 分钟；
③ 按照 10V/厘米的电压电泳，电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电泳。

（2）电转运
① 取和 EMSA 胶大小相近或略大的尼龙膜及两片滤纸，用 0.5×TBE 浸泡至少 10~15 分钟；
② 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上；
③ 小心地取出 EMSA 胶并放置到尼龙膜上；
④ 再把另外一片浸湿的滤纸放置到 EMSA 胶上；
⑤ 采用湿法电转膜装置，以 0.5×TBE 为转膜液，4 ℃，390 mA(约 100 V) 转膜 60 min。
⑥ 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

（3）紫外交联
① 用紫外交联仪 (UV-light cross-linker) 选择 254 nm 紫外波长，120 mJ/cm2，交联 45-60 秒；
② 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放 3-5 天，然后再进入下一步检测。

（4）化学发光反应
① 37-50 ℃ 水浴溶解封闭液和洗涤液。
② 交联过的尼龙膜加入 15 mL 封闭液，缓慢摇动 15 分钟；
③ 取 5 µL Streptavidin-HRP 加入到 15 mL 封闭液中 (1:2000 稀释)，混匀备用。
④ 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入 15 mL 含有 Streptavidin-HRP 的封闭液，缓慢摇动 30 分钟。
⑤ 将尼龙膜转移至另一装有 20 mL1×洗涤液（取 25 mL 5×洗涤液，加入 4 倍体积重蒸水或 MilliQ 级纯水混匀配制成 100 mL 1×洗涤液。）的容器内，缓慢摇动漂洗 1 分钟。
⑥ 去除洗涤液，加入 20 mL 1×洗涤液，缓慢摇动洗涤 5 分钟。
⑦ 重复上一步三次 (共四次)；
⑧ 将尼龙膜转移至另一装有 20 mL 检测平衡液的容器内，缓慢摇动 5 分钟；
⑨ 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多检测平衡液。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
⑩ 在尼龙膜的表面小心加上 ECL Plus Reagent 工作液（等体积 ECL Plus Reagent A 和 BeyoECL Plus Reagent B 混匀，体积为 0.02 ml/cm²），使工作液完全覆盖尼龙膜，室温静置 2-3 分钟。
⑪ 将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒内。
⑫ 用 X 光片压片，显影定影。

组别设置
1、阴性对照；
2、冷竞争探针 (50*)；
3、冷竞争探针 (100*)；
4、冷竞争探针 (50*，突变)；
5、冷竞争探针 (100*，突变)；
6、sample（转录因子/核蛋白抽提液+探针）；
7、supershift（核蛋白抽提液+探针+抗体，针对核蛋白抽提液，选做）；
8、阳性对照；