CircRREB1 mediates lipid metabolism related senescent phenotypes in chondrocytes through FASN post-translational modifications
《Nature Communications》（IF=16.600）
 

摘要：

 

骨关节炎是一种普遍的与年龄相关的疾病，其特征是细胞外基质代谢、脂质代谢失调和衰老相关分泌表型上调。

 

在此，我们阐明了CircRREB1在次生代软骨细胞中高表达，其缺失可以缓解FASN相关的衰老表型和骨关节炎进展。

 

CircRREB1通过抑制乙酰化介导的泛素化来抑制蛋白酶体介导的FASN降解。同时，CircRREB1诱导ranbp2介导的FASN的sumo化，并增强其蛋白的稳定性。

 

CircRREB1-FASN轴抑制FGF18和FGFR3介导的PI3K-AKT信号转导，进而增加p21的表达。关节内注射腺病毒-CircRreb1可逆转对CircRreb1缺陷小鼠的保护作用。

 

进一步的治疗干预可能在确定CircRREB1作为年龄相关性骨性关节炎的潜在预后和治疗靶点方面产生有益的作用。

在膝关节中，低氧张力促进了正常生理条件下软骨细胞的生长和功能。我们检测了第0代（P0）时软骨细胞的衰老表型，并在常氧或低氧条件下对其进行了两代（P2）的检测。P2软骨细胞表达了更多的与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）。

 

为了生成circRNA谱数据库，我们对P0代软骨细胞和P2软骨细胞进行了RNA-seq分析。RT-qPCR分析显示，CircRREB1在P2衰老软骨细胞中circRNA表达上调。

 

通过RT-qPCR检测衰老标记物p21和SASPs因子MMP13的表达。结果显示，下调CircRREB1显著降低了p21和MMP13的表达。因此，我们选择了CircRREB1作为一个潜在的靶点。

 

FISH染色和定量分析显示CircRREB1在软骨细胞和软骨组织中的表达增加。年龄切片进行CircRREB1 FISH染色结果显示CircRREB1的表达与年龄呈正相关。

 

用Doxo（100 nM）处理软骨细胞，在Doxo处理组中观察到更多表达CircRREB1的软骨细胞，我们还验证了CircRreb1在衰老小鼠和Terc+/−小鼠中的表达，并发现18个月龄小鼠的关节软骨比3个月龄小鼠有更高的CircRreb1表达。

我们认为CircRREB1是受rna结合蛋白的调控的。在软骨细胞中敲除DHX9后，CircRREB1的表达上调，而宿主基因RREB1的表达没有明显变化。软骨细胞中DHX9基因敲低也增加了p16和p21 mRNA的表达。

 

P2代软骨细胞中DHX9的下调至少是CircRREB1过表达的部分原因。抑制CircRREB1显著降低了ecm降解基因MMP3、MMP13和ADAMTS5和衰老相关基因p16、p21和p53的表达，并增加了SRY-Box转录因子9、聚合酶和Col2的表达。

 

接下来，我们研究了CircRreb1敲低对小鼠软骨细胞（MCs）中ECM代谢和衰老表型的影响。下调CircRreb1下调了衰老相关基因和ADAMTS5的表达，而上调了Aggrecan和Sox9的表达，在MCs中，CircRreb1的敲除也降低了SA-β-Gal阳性染色。

 

这些数据表明，CircRREB1/ CircRreb1在调节人类和小鼠软骨细胞的ECM代谢和衰老表型中具有显著作用。

我们成功地生成了CircRreb1 gKO小鼠。在CircRreb1 gKO小鼠中观察到的软骨损失更少。与WT小鼠相比，CircRreb1 gKO小鼠的MMP13、p16和p21阳性细胞减少。

 

3个月龄和18个月龄小鼠感染CircRreb1 AAV可分别增强软骨细胞中CircRreb1的过表达，DMM手术导致股骨和胫骨软骨中的蛋白多糖丢失，但在CircRreb1过表达后，蛋白多糖的丢失更为明显。

 

此外，在CircRreb1过表达后，与3月龄小鼠相比，18月龄小鼠出现严重的软骨损失。18个月龄小鼠的环状蛋白1加重了滑膜增生，并分子检测FLS标记物波形蛋白和巨噬细胞标记物F4/80，提示与衰老相关的OA严重程度。

 

骨赘的3D显微CT分析间接显示CircRreb1加重了衰老相关性OA的严重程度。18个月龄小鼠的CXCL1、p16表达增加，聚集聚糖表达降低。综上所述，CircRreb1加重了老年小鼠衰老的相关OA表型。

代谢途径的改变在包括OA6在内的各种疾病的发展中起着至关重要的作用。我们对P0和P2代软骨细胞进行了全面的代谢组学分析，富集分析表脂质代谢在其他代谢途径中占主导地位。

 

我们对老年小鼠、CircRREB1过表达系统和CircRreb1 gKO小鼠进行了脂质代谢组学研究。衰老小鼠的脂类增加。CircRREB1过表达后，人类软骨细胞中大多数类型的脂质也增加了。

 

由于年龄是骨性关节炎发展中最密切相关的因素之一，而脂质代谢与骨性关节炎相关，因此我们研究了脂质合成与衰老之间的关系。我们发现FASN、ELOVL5、ELOVL6和SCD1在老年组中表达增加，这些蛋白的相对强度也增加。

 

接下来，我们研究了CircRREB1与脂质合成之间的关系。免疫组化图像显示，CircRreb1 gKO小鼠（18个月）的关节软骨细胞FASN、ELOVL5、ELOVL6和SCD1表达较低。

 

CircRreb1 gKO小鼠软骨细胞脂质积累较低，表明CircRreb1在脂质合成中的作用。

免疫沉淀（AGO2 RIP）检测显示，CircRREB1没有与AGO2抗体结合。我们进行了RNA下拉和RPD-MS来探索和鉴定与CircRREB1相互作用的蛋白。

 

我们发现FASN是与CircRREB1相互作用的前20个蛋白之一。通过在hc和MCs中发现了FASN和CircRREB1之间的相互作用。

 

RIP检测结果显示，全长CircRREB1和片段2被FASN富集。通过EMSA进一步验证了CircRREB1和FASN之间的直接相互作用。

 

为了进一步研究FASN在软骨细胞ECM代谢和衰老表型中的作用，体外实验显示FASN或FASN敲低显著降低了软骨细胞的衰老表型。

 

用SA-β-Gal染色法评估FASN过表达后的衰老表型，结果显示FASN过表达加速了衰老表型的形成。我们在体内研究中研究了FASN对OA和衰老表型的影响。

 

藏红花O/Fast绿色和阿利新蓝染色显示，DMM手术后Fasn过表达加速了软骨的丢失。采用显微CT分析评估膝关节骨赘。

 

膝关节骨赘数量显示，DMM术后Fasn过表达增强了OA的程度。Fasn在加重衰老和OA表型中起着重要作用。

 

为了进一步探讨FASN介导的脂质代谢导致细胞衰老的机制，我们进行mRNA-seq检测FASN敲除后的下游基因。KEGG的富集表明，细胞衰老与FASN高度相关。

 

FASN调控TBHP治疗后的软骨细胞衰老。此外，FASN敲低时，衰老标记物的表达降低。当FASN沉默时，CircR过表达RREB1并没有改变Col2、Sox9等基因的表达，提示FASN介导了CircRREB1在OA中的功能。

 

证实了CircRREB1-FASN轴在促进年龄相关性OA进展中的作用。

CircRREB1的敲低或过表达在蛋白水平上调控FASN，而不是在mRNA水平上，表明CircRREB1转录后调控软骨细胞中FASN的表达。

 

为了确定哪些降解途径参与了FASN的降解，我们使用了溶酶体降解途径抑制剂氯喹（CQ）和蛋白酶体降解途径抑制剂硼替佐米（Borz）。

 

Borz处理的FASN FASN蛋白水平逐渐升高，而CQ处理的FASN蛋白水平无明显差异，表明蛋白酶体途径主要降解FASN。这些数据表明，CircRREB1增强了FASN的稳定性。我们研究了FASN的泛素化水平。

 

内源通路下调CircRREB1后FASN泛素化水平上调，内源通路过表达CircRREB1后FASN泛素化水平下调。CircRREB1通过抑制泛素-蛋白酶体降解途径来稳定FASN。

为了确定FASN的哪些乙酰化位点，我们进行了UPLCMS/MS分析，发现FASN中有两个乙酰化位点，K673和K1065。

 

Co-IP检测结果显示，K673和K1065突变体降低了FASN的乙酰化作用，其中K673突变体的作用更为明显，说明K673是FASN上的主要乙酰化位点。FASN上的K673突变体也降低了FASN的泛素化水平。

 

接下来，我们研究了CircRREB1对FASN乙酰化的影响。CircRREB1基因敲低增加了FASN的乙酰化，随后增强了与MDM2的相互作用，增加了FASN的泛素化。

 

我们想研究CircRREB1是否通过K48特异性泛素化调控FASN的泛素化。Co-IP结果显示，CircRREB1过表达降低了MDM2介导的K48特异性型泛素化。

 

综上所述，CircRREB1抑制了乙酰化介导的FASN泛素化，从而稳定了FASN并调节了其功能。

 

我们发现E3sumo-蛋白连接酶RanBP2，这是CircRREB1pulldown与Flag-FASN MS结果的交集，Co-IP结果显示，RanBP2的下调降低了FASN和UBC9之间的相互作用，随后FASN的sumo化水平降低。

 

CircRREB1基因敲除后，Co-IP检测显示，FASN与RanBP2的相互作用降低，FASN与UBC9的相互作用降低，随后FASN的sumo化下调。

 

总之，CircRREB1抑制了乙酰化介导的FASN泛素化，促进了ranbp2介导的FASN的sumo化，以稳定和维持其功能。

我们采用mRNA-seq检测CircRREB1敲除后的下游基因。KEGG富集分析还发现，PI3K-AKT信号转导是一个重要的下游信号通路。

 

在与PI3K-AKT信号通路相关的不同基因中，CircRREB1基因敲低后，FGFR3和FGF18表达显著上调。敲低CircRREB1或FASN也显著增加了FGFR3和FGF18 mRNA的表达，这一结果证实了FGFR3和FGF18是CircRREB1-FASN轴的下游靶点。

 

接下来，我们研究了CircRREB1-FASN轴如何调控FGFR3、FGF18和PI3K-AKT信号通路。CircRREB1敲低上调了FGFR3、FGF18、磷酸化pPI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）蛋白水平，FASN过表达逆转了这种作用。包括CircRREB1敲低诱导的信号转导分子。AKT的激活是PI3K-AKT信号通路的核心环节。

 

我们进行了救援研究，以研究CircRreb1过表达在cKO小鼠OA和衰老表型中的作用。与对照组小鼠相比，CircRreb1 cKO小鼠表现出更多的藏红花素O阳性区域；然而，接受DMM的动物出现软骨丢失和破坏，这在CircRreb1过表达后更为明显。

 

接受DMM和CircRreb1 AAV注射的动物比只接受DMM注射的动物表现出更严重的滑膜增生。在CircRreb1 cKO小鼠中，过表达CircRreb1后，OA和衰老表型发生了逆转。

 

我们还研究了CircRreb1在CircRreb1 cKO小鼠中的下游作用。在CircRreb1 cKO小鼠中，FASN水平降低；然而，FASN在DMM手术后表达上调，且CircRreb1过表达更为显著。

 

在CircRreb1 cKO小鼠中，研究了CircRreb1在脂质代谢中的作用。CircRreb1 cKO小鼠+ DMM组比CircRreb1 cKO组的脂质积累更大，这在过表达CircRreb1过表达后更为明显。

 

总之，本研究发现在衰老软骨细胞中高表达的CircRREB1，介导软骨细胞中脂质代谢相关的衰老相关分泌和OA表型。我们在体内外证实了FASN在ECM和衰老表型调控中的作用。

 

在本研究中，FASN是一个候选的circrreb1结合蛋白。在此，我们证明了CircRREB1-FASN轴通过介导脂质代谢相关的衰老表型，是与年龄相关的OA发病机制中的关键调控因子。

 

总之，我们提出了一种环状rna介导的脂质代谢相关的衰老调控机制。

作者使用伯信生物明星产品RNA pulldown、RIP试剂盒进行了上述筛选与分子互作调控机制的研究。