PARylated PDHE1α generates acetyl-CoA for local chromatin acetylation and DNAdamage repair

《nature structural & molecular biology》（IF=16.8008）
 

摘要：

染色质松弛是 DNA 修复机制进入双链断裂（DSBs）的先决条件。dsb 周围的局部组蛋白随后会发生乙酰化状态的迅速变化，但如何满足乙酰辅酶 a 的巨大需求尚不清楚。

在这里，我们报道了丙酮酸脱氢酶 1α（PDHE1α）催化丙酮酸代谢，快速提供乙酰辅酶 a，以响应 DNA 损伤。我们发现 PDHE1α 以多聚 adp 核糖化依赖的方式被快速招募到染色质，这驱动乙酰辅酶 a 的生成，以支持 dsb 周围的局部染色质乙酰化。这一过程增加了松弛染色质的形成，以促进修复因子加载、基因组稳定性和癌细胞对 dna 损伤治疗的抗性。

事实上，我们证明了阻断基于聚 adp-核糖基化的 PDHE1α 染色质招募可以减弱染色质弛豫和 DSB 修复能力，导致基因组不稳定性和恢复放射敏感性。这些缺陷支持了一种机制，即染色质相关的 PDHE1α 局部产生乙酰辅酶 a，以重塑与 dsb 相邻的染色质环境，并促进其修复。
 

定义染色质乙酰化的动态应对 DNA 损伤，我们评估了染色质和酸提取部分的赖氨酸乙酰化，研究发现，在 DNA 损伤治疗后，整体赖氨酸和核心组蛋白乙酰化水平均以剂量和时间依赖性的方式短暂增强。

 

通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测，4-OHT 处理诱导了 DSBs 周围泛 Ac 信号约 3 倍的富集。我们接下来发现，ACSS2 和 PDHE1α 都被招募到染色质中，而不是 ACLY，而 ACSS2 到染色质中的招募仅在 10 Gy 时增强。

 

我们的结果还表明，所有这三种成分都以时间和剂量依赖的方式定位于染色质部分。我们进一步应用了接近连接试验（PLA），并观察到 PDHE1α 和 γH2AX 之间的原位内源性相互作用对应的红点。

 

内源性 PDHE1α 与 γH2AX 和泛赖氨酸乙酰化信号在激光条纹中共定位的积累进一步证实了这一结论。

 

我们发现，激光触发了外源性过表达的 GFP 标记 PDHE1α 和内源性 GFP 敲入融合 PDHE1α 对激光条纹的显著和快速积累。

 

这些结果共同表明，PDHE1α 被招募到染色质上对于乙酰辅酶a的生成和染色质的乙酰化反应至关重要。

 

为了说明富含染色质的 PDHE1α 的功能，我们首先使用高响应的丙酮酸传感器 NLS-PyronicSF/pCMV-myc-nuc 监测丙酮酸动态，我们观察到微照射后，丙酮酸在 DSB 条纹周围的快速积累，这种效应在 PDHE1α 缺陷细胞中被消除。

为了说明丙酮酸在 DSB 周围的流动，我们用 13C 同位素标记丙酮酸，在 DNA 损伤时，在 DSB 位点检测到大量的蛋白质和乙酰化多肽。

对 13 个 c 标记的乙酰化蛋白进行乙酰组蛋白质组学分析，发现由丙酮酸衍生的乙酰供体主要是 DNA 损伤的结果。揭示了染色质重组与乙酰辅酶 a 代谢以及 DDR 之间的联系。

进一步评估激光诱导的 DNA 损伤位点的泛 Ac 水平显示，在 DNA 损伤轨道上，泛 Ac 信号显著增加，这种效应在很大程度上被 PDHE1α 消耗所抑制，而 ACLY 或 ACSS2 消耗没有被抑制。

这些观察结果表明，PDHE1α 衍生的局部乙酰辅酶 a 的产生确实对染色质的乙酰化很重要。此外，使用泛 ac 特异性抗体进行 ChIP 和测序显示，在野生型处理中，4-OHT 处理后，asisi 生成的 dsb 中分布的泛 ac 峰高度富集，而 PDHE1α 缺陷组没有富集。

总的来说，

PDHE1α 介导的乙酰辅酶 a 的生成是 DSBs 周围染色质乙酰化所必需的。

 

 

 

为了解 PDHE1αpar 结合对其酶活性的影响，我们拯救 PDHE1α 结合缺陷突变体 PDHE1α 敲除（KO）细胞，发现这些突变体没有 PDHE1α 酶活性的变化，但显示明显减少双边带网站响应红外。通过对 asisi 生成的 dsb 中泛 ac 信号的 ChIP-seq 分析，进一步验证了这一结论。

接下来，我们进行了微球菌核酸酶（MNase）敏感性试验，数据显示，依托泊苷处理增加了 MNase 对 WT 细胞染色质的可及性，而不是 PDHE1α-KO 细胞，这表明单/di/三核小体的密度显著增加。

接下来，我们克隆了三个酶活性死亡的临床热点突变的 PDHE1α，K313R、R302C 和 R378 H。我们首先证实了这些突变体没有酶活性。此外，这些突变体并不影响其招募，但不能调节泛 ac。

同样，挽救这些酶死亡的突变体并不能增加染色质的可及性以及修复因子对 DNA 损伤的加载能力。这些结果表明，PDHE1α 配对化和酶活性是确保 DNA 损伤后染色质可及性所必需的。

为了了解富含染色质的 PDHE1α 在 DDR 中的功能，用彗星实验来检测单个细胞中的 DNA 损伤。我们观察到，在 DNA 损伤 8 小时后，有更高比例的 PDHE1α-KO 细胞含有残留的 DSB 病变)。

通过使用 γH2AX 作为替代标记物监测 DSB 积累动力学，我们发现 PDHE1α 缺失不仅导致 DSB 延迟积累，而且增加了 DNA 损伤后 8 小时持续 DSB 的细胞百分比。这些观察结果共同表明，PDHE1α 在 DSB 修复中起着重要的作用。

我们进一步观察到，par 结合缺陷突变体未能挽救 DNA 损伤后尾部时刻持续的 DNA 损伤水平。通过将不同的 PDHE1α 构建物拯救到 PDHE1α 缺陷细胞中，修复报告系统进一步证实了这一结论。

最后，我们通过评估 DSB 修复后 PDHE1α 缺陷细胞的染色体断裂，进一步分析了染色体的稳定性。我们发现，PDHE1α 缺失显著增加了染色体断裂，由于 DNA 损伤修复效率的降低，par 结合和酶活性死亡的突变体都有更多的染色体断裂。

这些数据表明，染色质富集的 PDHE1α 在促进 DSB 修复以维持基因组稳定性方面具有关键作用。
 

为了表征 PDHE1α 在基因毒性耐药性中的生物学相关性，我们对细胞进行了 IR 处理，集落形成试验显示，PDHE1α 缺陷的细胞对 IR 处理表现出超敏性。挽救 par 结合缺陷突变体并没有逆转 PDHE1α 缺陷引起的敏感性。

为了检测 PDHE1α 是否参与了对基因毒性治疗的耐药性，我们评估了接受化疗/放疗患者的临床乳腺癌组织中 PDHE1α/泛 ac 信号轴的临床相关性。

PDHE1α 高的表达与高泛酸信号呈正相关，高 PDHE1α 表达和泛酸水平对接受基因毒性治疗的患者总生存率显著降低，表明 PDHE1α 在基因毒性治疗耐药中具有关键的临床相关性。

我们使用 PDHE1α-KO C57 小鼠模型进一步评估了 PDHE1α 在放疗耐药性中的作用。PDHE1α 缺陷小鼠（Pdha1f/f；CMVCre）的寿命较短，与 Pdha1f/f 小鼠相比，放射治疗后萎缩的修复被延迟。

CMVCre 小鼠的空肠组织中存在高水平的残留 DNA 损伤和凋亡，但放疗后的泛 ac 水平较低。总之，这些结果表明，PDHE1α 的表达赋予了体内细胞的辐射抗性。

接下来，我们将稳定表达 PDHE1αpar 结合缺陷突变体的克隆注射到裸鼠中，并监测皮下肿瘤在体内对 DNA 损伤的反应。与 WT 组相比，par 结合缺陷肿瘤对放射治疗的敏感性显著增强，但对小鼠体重没有影响，表明染色质 PDHE1α 在体内肿瘤的放射耐药中起着关键作用。

这些结果表明，PDHE1α 的配对修饰显著有助于癌细胞对 dna 损伤治疗的耐药性。
 

在本研究中，我们展示了 PDHE1α 在 DSB 位点以 pary 化依赖的方式催化局部乙酰辅酶 a 生物合成和染色质乙酰化的时空功能（图 8）。本报告中的研究结果强调了乙酰辅酶 a 的来源以及染色质相关的 PDHE1α 在 DSB 修复和放化疗耐药性中的作用。

我们的发现为进一步研究局部代谢物在表观遗传调控中的作用以及开发调节癌症代谢的 PDHE1α 靶向治疗提供了动力，最重要的是，破坏癌细胞抵抗基因毒性损伤的关键机制。

 

作者使用伯信生物明星产品 Reverse-ChIP 试剂盒进行了上述筛选与分子互作调控机制的研究。