N6-methyladenosine-modifed circRIMS2 mediates synaptic and memory impairments by activating GluN2B ubiquitination in Alzheimer’s disease

《Translational Neurodegeneration》（IF=12.6005） 

​背景 

突触退化发生在阿尔茨海默病（AD）的早期阶段，在毁灭性的症状之前，与认知能力下降密切相关。环状 rna（环状 rna）在神经组织中大量丰富，环状 rna 的异常表达先于 AD 症状，与临床痴呆的严重程度显著相关。然而，AD 早期环状 rna 失调与突触损伤之间的直接关系尚不清楚。

方法 

通过海马全转录组测序来鉴定 4 个月大的野生型和 APP/PS1 小鼠的失调环状 rna 和 miRNAs。利用 RNA 反义纯化和质谱技术揭示了 circRIMS2 与甲基转移酶 3、n6-腺苷-甲基转移酶复合物催化亚基（METTL3）之间的相互作用。

circRIMS2/miR-3968 在突触靶向 ube2k 介导的 NMDA 受体 GluN2B 亚基泛素化中的作用通过许多慢病毒，随后通过形态学染色、共免疫共沉淀和行为测试进行评估。此外，我们还使用了一种膜透性肽来阻断 AD 小鼠中 K1082 在 GluN2B 上的泛素化。

 

结果

circRIMS2 在 4 个月大的 APP/PS1 小鼠中显著上调，这是由 mettl3 依赖的 n6-甲基腺苷（m6A）修饰介导的。过表达 circRIMS2 导致 4 月龄 C57BL/6 小鼠的突触和记忆障碍。MiR-3968/UBE2K 被验证为 circRIMS2 的下游。UBE2K 水平的升高可通过泛素化 GluN2B 上的 K1082 来诱导 AD 的突触功能障碍。沉默 METTL3 或阻断 K1082 在 GluN2B 上的泛素化，可以显著挽救 AD 小鼠的突触功能障碍。

 

结论 

总之，我们的研究表明，m6a 修饰的 circRIMS2 通过海绵化 miR-3968 激活 ube2k 依赖的 GluN2B 泛素化和降解，介导 AD 的突触和记忆损伤，为 AD 提供了新的治疗策略。

 

 

在 AD 早期和前-痴呆症症状。我们进行了 RNA 测序鉴定,qRT-PCR 验证了 APP/ PS1 小鼠中 circRIMS2/miR-3968 ceRNA 成对的上调，且 circRIMS2 的上调和下调 miR-3968。在 3×Tg 小鼠和 Aβ 处理的初级皮质小鼠神经元中，我们观察到 circRIMS2/miR-3968 类似的变化，表明该通路在几种 AD 模型中被异常激活。

FISH 鉴定了 circRIMS2 和 miR-3968 在 N2a 细胞的细胞质中的共定位。双荧光素酶报告基因检测和 qRT-PCR 结果显示，circRIMS2 抑制了 miR-3968 的表达，表明其 miRNA 海绵潜能。actinomycin D 用于阻断新的 RNA 合成，circRIMS2 比线性 RIMS2 具有更高的稳定性。

circRIMS2 在细胞内的分布在 N2a 细胞的细胞核和细胞质之间没有明显的差异。我们发现 circRIMS2 被 Ago2 显著富集，表明其 miRNA 海绵潜力。
 

在 4 个月大的 APP/PS1 小鼠中，circRIMS2 的 Te m6A 水平显著上调。

RNA 下拉和质谱分析认为 METTL3 是一个与 circrims2 结合的 m6A 调节因子. 过表达 METTL3 增加了 circRIMS2 的 m6A 水平。敲除 METTL3 逆转了 Aβ 诱导的 N2a 细胞中 circRIMS2 的 m6A 修饰，并降低了 Nc2a 细胞中 ActcRIMS2 的稳定性。

这些结果表明，mettl3 介导的 m6A 修饰稳定了 circRIMS2。

为了说明 circRIMS2 在 AD 发病机制中的作用，我们将一种含有 circRIMS2 的慢病毒注射到 4 月龄 C57BL/6 小鼠的海马中。过表达 circRIMS2 的小鼠在学习阶段表现出更长的潜伏期。高尔基体染色观察到树突棘密度和蘑菇型棘的百分比的降低。circRIMS2 的过表达会降低突触蛋白的蛋白水平，包括 GluN2B 和 GluN2A。

此外，我们观察到 circRIMS2 可以海绵化 miR-3968，并导致体内 miR-3968 的减少。这些结果表明，circRIMS2 的过表达诱导了体内的记忆和突触损伤。

 

我们运用 3 个软件预测 miR-3968 的靶点，它介导 AD 的突触功能障碍，均发现了 21 个基因，这些基因在蛋白泛素化 GO 项中富集。我们选择了 TRIM62、RC3 H1 和泛素结合酶 E2 K（UBE2K）作为进一步验证的候选酶。实验表明，在过表达 mir-3968 的 N2a 细胞中，只有 UBE2K 蛋白水平显著下调，表明 UBE2K 是 miR-3968 的潜在靶点。

我们进行了荧光素酶活性测定，发现在 HEK293 细胞中，miR-3968 只降低了 WT UBE2K 的荧光素酶活性，而没有降低 UBE2K3『UTR 的两个突变体。我们观察到，上调 miR-3968 或沉默 UBE2K 可以挽救过表达 circRIMS2 的小鼠的记忆和突触损伤。

我们进一步研究了 UBE2K 介导 AD 突触损伤的下游靶点，发现 GluN2B 可能是 NMDA 受体的一个亚基，可能是神经元通信 [27] 的重要靶点。研究表明，UBE2K 可能直接与 GluN2B 相互作用，介导其泛素化和降解，因为过表达 UBE2K 降低了 GluN2B 蛋白水平，而 UBE2K 沉默增加了 GluN2B 蛋白水平。

在C57BL/6小鼠中，GluN2B抗体也可以降低UBE2K。此外，在APP/PS1小鼠和ube2k转染的N2a细胞中，GluN2B蛋白水平降低，而泛素化水平升高。我们使用GPS-Uber预测了GluN2B中潜在的泛素化位点，发现了fve高度保守的泛素化位点。荧光素酶活性测定提示GluN2B可能不是miR-3968的直接靶点。

这些数据表明，circRIMS2/ miR-3968 通路的上调可能通过 K1082 位点的 GluN2B 泛素化导致 UBE2K 的异常激活和 GluN2B 的降解。

 

我们研究了下调 circRIMS2/miR-3968/UBE2K 通路是否可以挽救 AD 患者的突触和记忆损伤。通过上调 miR- 3968 或沉默 UBE2K 来下调该通路。含有 miR-3968 或 shUBE2K 的慢病毒注入 APP/ PS1 小鼠的海马中，部分挽救了记忆损伤，逆转了 APP/PS1 小鼠突触蛋白的蛋白水平，表明下调 circRIMS2/miR- 3968/UBE2K 通路显著挽救了 AD 的突触和记忆损伤。

我们生成了两个分别重叠于 K1082 和 K1097 泛素化位点的多肽段。sip-1082 可以逆转 N2a 细胞中过表达 UBE2K 所引起的 GluN2B 蛋白水平的下降。表明只有 K1082R 突变而不是 K1097R 突变消除了 UBE2K 与 GluN2B-2 之间的相互作用。

我们给药 sip-1082 在 12 个月大的 APP/PS1 小鼠。在 NOR 和 MWM 测试中，处理显著提高了其学习能力，恢复了神经元树突的密度、成熟和复杂性，抑制了 GluN2B 泛素化，增加了 GluN2B 蛋白水平。结果表明，阻断 ube2k 介导的 GluN2B 泛素化可以显著挽救 AD 小鼠的突触和记忆损伤。阻断 circRIMS2/ miR-3968/UBE2K/GluN2B 轴可显著改善 APP/PS1 小鼠的突触功能障碍。

我们还应用 MeRIP-PCR 检测 N2a 细胞中转染 METTL3 后 UBE2K 和 GluN2B 的 m6A 水平，结果显示 METTL3 未染 UBE2K 和 GluN2B 的 m6A 水平，部分排除了 METTL3 对 UBE2K 和 GluN2B 的直接 m6A 修饰调控。在 MWM 和 NOR 测试中，沉默 METTL3 部分挽救了记忆障碍，逆转了 APP/PS1 小鼠的突触蛋白水平以及 circRIMS2 的表达和 m6A 水平，表明下调 METTL3 可显著减轻 APP/PS1 小鼠的 AD 病理。

在本研究中，我们在 AD 中发现了一个异常上调的 circRIMS2/miR-3968 ceRNA 对。该通路的上调导致了 UBE2K 的增加和泛素化介导的 GluN2B 的降解，从而导致记忆和突触损伤。

此外，阻断 circRIMS2/miR-3968/UBE2K/ GluN2B 轴可显著改善 APP/PS1 小鼠的突触功能障碍。

总之，我们对 AD 早期阶段的 circRNA/miRNA 的表达模式进行了表征，其中小鼠有突触功能障碍，但没有明显的 Aβ 沉积。

我们揭示了上调的 circRIMS2/miR-3968 通路通过激活 ube2k 介导的 GluN2B 泛素化和降解，介导 AD 突触和记忆损伤的重要作用。

此外，我们还发现，阻断 GluN2B 的泛素化可以改善 AD 模型小鼠的突触功能障碍。我们的工作提出了几个新的治疗靶点来克服突触和记忆障碍。
 

 

作者使用伯信生物明星产品 circRNA      表达载体、RAP、FISH 以及探针进行了上述筛选与分子互作调控机制的研究。