TRAP（tagged RNA affinity purification）是一种检测 RNA 与 RNA 互作以及 RNA 与 RNA 结合的蛋白质（RBPs）互作的检测方法;

TRAP 方法首先通过设计 GST-MS2 融合表达载体和 ncRNA-MS2 茎环结构串联重复载体，共转细胞获得 GST-MS2 融合蛋白和 ncRNA-MS2 融合 RNA，在胞内形成 GST-MS2~ncRNA-MS2 与蛋白或 RNA 的复合体，最后裂解细胞，利用谷胱甘肽亲和琼脂糖珠子进行拉取，获得目的 RNA-RNA 复合物或目的蛋白-RNA 复合物，进一步分离纯化获得目的 RNA 或目的蛋白进行下一步检测分析。
 

 

技术应用

研究 RNA 与 RNA 的互作，分析目标 RNA 结合的 ncRNA 和 mRNA；
研究 RNA 与蛋白的互作，分析目标 RNA 结合的蛋白质。

操作步骤

1. 细胞培养，转染
2×10⁷ 细胞分为两组，一组共同转染 18 μg MS2-ncRNA 质粒和 MS2 GST 质粒，另一组共同转染 18 μg MS2 质粒和 MS2 GST 质粒；培养 48 小时。

2. 裂解物的制备
① 加入裂解液，冰上裂解细胞 15 分钟；
② 离心，取上清液。

3. Pulldown
把磁珠与上清液共同 4 ℃ 温和旋转孵育过夜。

4. RNP 收集
① 分别将 ncRNA-MS2 TRAP protein 和 MS2 TRAP protein 组珠子加入洗脱液，37 ℃ 摇动 2 h，收集上清；
② 银染检测；
③ Western Blot 检测或 LC-MS 检测；
④ 剩余样品 -80 ℃ 保存备用。

5. RNA 纯化
① 55 ℃ 下垂直旋转孵育；
② 取上清进行洗脱，涡旋混匀，静置 5 min；
③ 离心后收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；
④ 配制纯化体系，颠倒混合；
⑤ 在 -20 ℃ 放置 2 小时后，在 4 ℃ 下以 12 000×g 离心 20 分钟；
⑥ 75％ 乙醇洗涤得到的 RNA 沉淀，去除上清液；干燥 RNA 颗粒，溶解 RNA。

6. RNA 分析
① 取 RNA 样品检测 RNA 浓度；
② 逆转录 RNA 样品、进行 PCR，PCR 产物 3% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
③ qPCR 或高通量测序技术检测 RNA 类型。

分组设置
 

靶向调控基因分组	靶向调控基因注释	TRAP 分组	TRAP 分组注释
阳性对照	目标基因	Input 组 ncRNA-MS2 TRAP 组 MS2 TRAP 组	样本对照组 实验组 阴性对照组
研究基因	靶向基因	Input 组 ncRNA-MS2 TRAP 组 MS2 TRAP 组	样本对照组 实验组 阴性对照组
阴性对照	GAPDH、β-acti	Input 组 ncRNA-MS2 TRAP 组 MS2 TRAP 组	样本对照组 实验组 阴性对照组