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分子探针与表观遗传学研究好文分享：METTL3/YTHDC1药物治疗的m6A修饰circRNA3634通过miR1244865MAPK1轴调控鹿角软骨细胞的增殖和分化
人阅读 发布时间：2024-01-26 13:30
METTL3/YTHDC1medicated m6A modifcation of circRNA3634 regulates the proliferation and diferentiation of antler chondrocytes by miR-124486-5-MAPK1 axis《Cellular & Molecular Biology Letters》（IF=8.3001）
背景 鹿角是一种非凡的哺乳动物附属物，其生长速度超过了任何其他已知的骨器官。新的证据表明，circRNA和MAPK1在软骨细胞中发挥了关键作用。因此，探索其在鹿角软骨细胞中的作用，将有助于我们了解鹿角快速生长的调控机制。
方法 采用qRT-PCR、western blot和免疫组化方法检测mrna和蛋白的表达。CCK-8、EdU、细胞迁移、ALP活性检测和ALP染色检测了MAPK1在鹿角软骨细胞中的作用。采用FISH、RIP和荧光素酶检测来评估circRNA3634/MAPK1和miR-124486-5之间的相互作用。RIP和RAP检测证实了circRNA3634与rbp之间的结合相互作用。Me-RIP用于测定环状rna3634的m6A甲基化修饰。
结果 本研究发现MAPK1在鹿角软骨组织中高表达。过表达MAPK1促进了鹿角软骨细胞的增殖、迁移和分化，增加了MAPK3、RAF1、MEK1、RUNX2和SOX9的表达。MAPK1被沉默的效果则相反。CircRNA3634被发现作为miR-124486-5的分子海绵，通过竞争性的miR-124486-5结合，导致MAPK1表达增加，增强鹿角软骨细胞的增殖和迁移。我们发现METTL3介导circRNA3634剪接位点附近的m6A修饰，并参与鹿角软骨细胞的增殖和分化。m6A读取器YTHDC1以m6A依赖的方式促进了circRNA3634的核输出.我们的研究结果表明，m6未修饰的circRNA3634通过靶向MAPK1促进鹿角软骨细胞的增殖，并表明circRNA3634的核输出与YTHDC1的表达有关，这表明circRNA3634可能是鹿角的关键再生标志。
结论 我们的研究结果显示，一种新的m6a修饰的circRNA3634通过调节MAPK1促进鹿角软骨细胞的增殖和分化。circRNA3634的核输出与YTHDC1的表达有关。
梅花鹿角软骨组织中MAPK1和MAPK3基因在鹿角软骨组织中高表达。为了研究MAPK1的生物学功能，构建了pcDNA3.1-MAPK1质粒，并将其转染到鹿角软骨细胞中，我们发现OEMAPK1增加了pERK1/2/t-ERK1/2的比值，OEMAPK1可显著促进细胞增殖，沉默MAPK1（si-MAPK1）可抑制细胞增殖。ALP活性测定和ALP染色显示，OE-MAPK1增加了鹿角软骨细胞的ALP活性和成骨分化。qRTPCR和western blot结果显示，OE-MAPK1在mRNA和蛋白水平上上调了MAPK3（ERK1）、RAF1、REK1、RUNX2和SOX9的表达。
我们使用生物信息学工具来预测环状rna-miRNA-MAPK1轴。基于整个转录组测序结果，我们选择了3种高表达的环状rna，并检测了它们在鹿角软骨和间充质组织中的差异表达。其中，circRNA3634在组织间的表达差异最为显著，通过Sanger测序证实了circRNA3634的环状结构，验证了其后剪接位点（图2C）。荧光原位杂交（FISH）显示，circRNA3634主要定位于细胞质（图2F），提示它可能是一种竞争的内源性RNA（ceRNA）。
将pcDNA3.1-circRNA3634及其对照质粒转染鹿角软骨细胞，CCK-8和EdU检测结果显示，OE-circRNA3634促进了鹿角软骨细胞的增殖，OE-circRNA3634增强了细胞迁移（图3G，H）。鹿角软骨细胞中OE-circRNA3634导致MAPK1 mRNA和t-ERK1/2蛋白表达显著增加，而si-circrRNA3634的表达则相反（图3K-Q）。OE-circRNA3634增加了p-ERK1/2的比例，这说明circRNA3634参与了ERK信号通路的激活。
RNA免疫沉淀（RIP）检测显示，AGO2抗体中circRNA3634和miR-124486-5显著富集，表明circRNA3634与miR-124486-5结合。双荧光素酶检测表明circRNA3634特异性靶向并与miR-124486-5结合。miR-124486-5 mimic降低了野生型MAPK1的相对荧光素酶活性，但对突变型MAPK1没有明显影响，表明miR-124486-5作为靶点并与MAPK1的3ʹUTR结合。我们研究了miR-124486-5在鹿角软骨细胞中的生物学功能。miR- 124486-5在鹿角软骨组织中的表达明显少于在间充质组织中。CCK-8、EdU和细胞迁移实验表明，miR-124486-5模拟物抑制了鹿角软骨细胞的增殖和迁移，降低了MAPK1 mRNA、t-ERK1mRNA和p-ERK1/2蛋白的表达量，以及p-ERK1/2水平。这些结果表明，miR-124486-5通过与MAPK1相互作用在鹿角软骨细胞中发挥作用。
将鹿角软骨细胞与pcDNA3.1-circRNA3634和miR- 124486-5模拟物共转染，以评估circRNA3634是否抵消了模拟物的抑制作用。CCK-8和EdU检测结果显示，OE-circRNA3634部分恢复了miR-124486-5模拟物诱导的对鹿角软骨细胞增殖的抑制作用。OE-circRNA3634部分挽救了miR-124486-5模拟物诱导的对鹿角软骨细胞迁移的抑制作用。mE-circRNA3634可部分逆转miR-124486-5模拟物中MAPK1mRNAmRNA表达、t-ERK1/2表达和p-ERK1/2蛋白表达的下降。这些研究结果共同表明，circRNA3634通过circRNA3634-miR-124486-5-MAPK1轴调控鹿角软骨细胞的增殖和迁移。
为了进一步探索circRNA3634促进鹿角软骨细胞增殖、迁移和分化的潜在分子机制，catRAPID预测提示circRNA3634与m6A甲基化相关。MeRIP-PCR显示，circRNA3634外显子20-16连接区显著富集，与m6A修饰的存在。通过RIP-PCR、RAP和质谱分析验证了METTL3与circRNA3634之间的结合相互作用，鹿角软骨细胞中METTL3表达的减少减弱了这种相互作用。MeRIP-PCR结果显示，si-METTL3导致m6A下降circRNA3634水平，表明在circRNA3634 m6A修饰物上的METTL3表达。我们还发现si-METTL3降低了circRNA3634的稳定性和表达量，同时，si-METTL3降低了MAPK1、RAF1、MEK1、RUNX2和SOX9的mRNA表达。si-METTL3抑制了鹿角软骨细胞的增殖、软骨细胞的迁移以及软骨细胞的ALP活性和成骨分化。
YTHDC1是一种m6A解读蛋白，RIP-PCR显示了YTHDC1与circRNA3634的结合相互作用。FISH结果显示，在鹿角软骨细胞中转染YTHDC1siRNA48h的circRNA3634主要定位于细胞核，而不是细胞质中，si-YTHDC1降低了circRNA3634的表达。说明YTHDC1与circRNA3634结合并促进其以m6a依赖的方式从核到细胞质输出的作用的证据。si-YTHDC1降低了MAPK1 mRNA的表达以及p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白的表达。 CCK-8和细胞迁移实验显示，si-YTHDC1抑制了鹿角软骨细胞的增殖和迁移能力，ALP活性测定和ALP染色测定显示，si-YTHDC1对鹿角软骨细胞分化无明显影响。
我们的研究结果表明，MAPK1是鹿角软骨细胞增殖和分化的正调控因子。此外，circRNA3634在鹿角软骨细胞中表达上调，并作为ceRNA通过miR- 124486-5-MAPK1轴促进这些细胞的增殖、迁移和分化。METTL3参与了circRNA3634的m6A修饰和鹿角软骨细胞的增殖分化。在机制上，m6A解读器YTHDC1以m6A甲基化依赖的方式促进了circRNA3634的核输出。我们的信息提供了对m6A修饰参与鹿角软骨细胞过程，为研究鹿角快速生长的机制提供了新的视角。
背景 鹿角是一种非凡的哺乳动物附属物，其生长速度超过了任何其他已知的骨器官。新的证据表明，circRNA和MAPK1在软骨细胞中发挥了关键作用。因此，探索其在鹿角软骨细胞中的作用，将有助于我们了解鹿角快速生长的调控机制。
方法 采用qRT-PCR、western blot和免疫组化方法检测mrna和蛋白的表达。CCK-8、EdU、细胞迁移、ALP活性检测和ALP染色检测了MAPK1在鹿角软骨细胞中的作用。采用FISH、RIP和荧光素酶检测来评估circRNA3634/MAPK1和miR-124486-5之间的相互作用。RIP和RAP检测证实了circRNA3634与rbp之间的结合相互作用。Me-RIP用于测定环状rna3634的m6A甲基化修饰。
结果 本研究发现MAPK1在鹿角软骨组织中高表达。过表达MAPK1促进了鹿角软骨细胞的增殖、迁移和分化，增加了MAPK3、RAF1、MEK1、RUNX2和SOX9的表达。MAPK1被沉默的效果则相反。CircRNA3634被发现作为miR-124486-5的分子海绵，通过竞争性的miR-124486-5结合，导致MAPK1表达增加，增强鹿角软骨细胞的增殖和迁移。我们发现METTL3介导circRNA3634剪接位点附近的m6A修饰，并参与鹿角软骨细胞的增殖和分化。m6A读取器YTHDC1以m6A依赖的方式促进了circRNA3634的核输出.我们的研究结果表明，m6未修饰的circRNA3634通过靶向MAPK1促进鹿角软骨细胞的增殖，并表明circRNA3634的核输出与YTHDC1的表达有关，这表明circRNA3634可能是鹿角的关键再生标志。
结论 我们的研究结果显示，一种新的m6a修饰的circRNA3634通过调节MAPK1促进鹿角软骨细胞的增殖和分化。circRNA3634的核输出与YTHDC1的表达有关。
梅花鹿角软骨组织中MAPK1和MAPK3基因在鹿角软骨组织中高表达。为了研究MAPK1的生物学功能，构建了pcDNA3.1-MAPK1质粒，并将其转染到鹿角软骨细胞中，我们发现OEMAPK1增加了pERK1/2/t-ERK1/2的比值，OEMAPK1可显著促进细胞增殖，沉默MAPK1（si-MAPK1）可抑制细胞增殖。ALP活性测定和ALP染色显示，OE-MAPK1增加了鹿角软骨细胞的ALP活性和成骨分化。qRTPCR和western blot结果显示，OE-MAPK1在mRNA和蛋白水平上上调了MAPK3（ERK1）、RAF1、REK1、RUNX2和SOX9的表达。
我们使用生物信息学工具来预测环状rna-miRNA-MAPK1轴。基于整个转录组测序结果，我们选择了3种高表达的环状rna，并检测了它们在鹿角软骨和间充质组织中的差异表达。其中，circRNA3634在组织间的表达差异最为显著，通过Sanger测序证实了circRNA3634的环状结构，验证了其后剪接位点（图2C）。荧光原位杂交（FISH）显示，circRNA3634主要定位于细胞质（图2F），提示它可能是一种竞争的内源性RNA（ceRNA）。
将pcDNA3.1-circRNA3634及其对照质粒转染鹿角软骨细胞，CCK-8和EdU检测结果显示，OE-circRNA3634促进了鹿角软骨细胞的增殖，OE-circRNA3634增强了细胞迁移（图3G，H）。鹿角软骨细胞中OE-circRNA3634导致MAPK1 mRNA和t-ERK1/2蛋白表达显著增加，而si-circrRNA3634的表达则相反（图3K-Q）。OE-circRNA3634增加了p-ERK1/2的比例，这说明circRNA3634参与了ERK信号通路的激活。
RNA免疫沉淀（RIP）检测显示，AGO2抗体中circRNA3634和miR-124486-5显著富集，表明circRNA3634与miR-124486-5结合。双荧光素酶检测表明circRNA3634特异性靶向并与miR-124486-5结合。miR-124486-5 mimic降低了野生型MAPK1的相对荧光素酶活性，但对突变型MAPK1没有明显影响，表明miR-124486-5作为靶点并与MAPK1的3ʹUTR结合。我们研究了miR-124486-5在鹿角软骨细胞中的生物学功能。miR- 124486-5在鹿角软骨组织中的表达明显少于在间充质组织中。CCK-8、EdU和细胞迁移实验表明，miR-124486-5模拟物抑制了鹿角软骨细胞的增殖和迁移，降低了MAPK1 mRNA、t-ERK1mRNA和p-ERK1/2蛋白的表达量，以及p-ERK1/2水平。这些结果表明，miR-124486-5通过与MAPK1相互作用在鹿角软骨细胞中发挥作用。
将鹿角软骨细胞与pcDNA3.1-circRNA3634和miR- 124486-5模拟物共转染，以评估circRNA3634是否抵消了模拟物的抑制作用。CCK-8和EdU检测结果显示，OE-circRNA3634部分恢复了miR-124486-5模拟物诱导的对鹿角软骨细胞增殖的抑制作用。OE-circRNA3634部分挽救了miR-124486-5模拟物诱导的对鹿角软骨细胞迁移的抑制作用。mE-circRNA3634可部分逆转miR-124486-5模拟物中MAPK1mRNAmRNA表达、t-ERK1/2表达和p-ERK1/2蛋白表达的下降。这些研究结果共同表明，circRNA3634通过circRNA3634-miR-124486-5-MAPK1轴调控鹿角软骨细胞的增殖和迁移。
为了进一步探索circRNA3634促进鹿角软骨细胞增殖、迁移和分化的潜在分子机制，catRAPID预测提示circRNA3634与m6A甲基化相关。MeRIP-PCR显示，circRNA3634外显子20-16连接区显著富集，与m6A修饰的存在。通过RIP-PCR、RAP和质谱分析验证了METTL3与circRNA3634之间的结合相互作用，鹿角软骨细胞中METTL3表达的减少减弱了这种相互作用。MeRIP-PCR结果显示，si-METTL3导致m6A下降circRNA3634水平，表明在circRNA3634 m6A修饰物上的METTL3表达。我们还发现si-METTL3降低了circRNA3634的稳定性和表达量，同时，si-METTL3降低了MAPK1、RAF1、MEK1、RUNX2和SOX9的mRNA表达。si-METTL3抑制了鹿角软骨细胞的增殖、软骨细胞的迁移以及软骨细胞的ALP活性和成骨分化。
YTHDC1是一种m6A解读蛋白，RIP-PCR显示了YTHDC1与circRNA3634的结合相互作用。FISH结果显示，在鹿角软骨细胞中转染YTHDC1siRNA48h的circRNA3634主要定位于细胞核，而不是细胞质中，si-YTHDC1降低了circRNA3634的表达。说明YTHDC1与circRNA3634结合并促进其以m6a依赖的方式从核到细胞质输出的作用的证据。si-YTHDC1降低了MAPK1 mRNA的表达以及p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白的表达。 CCK-8和细胞迁移实验显示，si-YTHDC1抑制了鹿角软骨细胞的增殖和迁移能力，ALP活性测定和ALP染色测定显示，si-YTHDC1对鹿角软骨细胞分化无明显影响。
我们的研究结果表明，MAPK1是鹿角软骨细胞增殖和分化的正调控因子。此外，circRNA3634在鹿角软骨细胞中表达上调，并作为ceRNA通过miR- 124486-5-MAPK1轴促进这些细胞的增殖、迁移和分化。METTL3参与了circRNA3634的m6A修饰和鹿角软骨细胞的增殖分化。在机制上，m6A解读器YTHDC1以m6A甲基化依赖的方式促进了circRNA3634的核输出。我们的信息提供了对m6A修饰参与鹿角软骨细胞过程，为研究鹿角快速生长的机制提供了新的视角。
作者使用伯信生物明星产品RIP、RAP试剂盒进行了上述筛选与分子互作调控机制的研究。
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